酵母表達純化服務
酵母蛋白表達系統是一種高經濟性的真核表達系統，可分泌表達表達也可胞內表達。
酵母表達外源基因具有一定的翻譯后加工能力，所表達的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達的蛋白質更加穩定，特別適用于真核基因表達和功能蛋白的制備。
酵母分泌表達可以將表達的外源蛋白分泌到細胞外基質中，因此更容易獲得高純度蛋白。
酵母表達系統具有的諸多優勢使其研究和應用越來越廣泛。
系統優勢
- 無自產內毒素；
- 產物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰酯化等，蛋白具有生物活性的可能性更高；
- 產物可正確折疊和高效分泌；
- 性質較原核表達的蛋白質更加穩定，特別適合于表達和制備具有功能的蛋白：如結核類蛋白、防御素類蛋白、白介素蛋白及細胞因子等。
服務優勢
- 無風險定制，不成功不收費；
- 特有的PickRight技術，轉化后免篩選直接可獲得高表達量菌株，相比傳統篩選節省5-10個工作日；
- 高產量：搖瓶培養條件下高達100mg/L；
- 高性價比：價格低至5200元起；
- 貨期短：最短35工作日即可交付。
我們承諾
注：該無風險定制蛋白服務僅適用于800個氨基酸以內的蛋白質。如果您需要表達超過800個氨基酸的蛋白質，我們將按步驟收費。
服務內容
| 步驟 | 服務項目 | 服務說明 | 華美生物特色 | 周期 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 表達載體構建
 |
密碼子優化全基因合成 | 多載體優化 為了提高的表達成功率以及獲得更高表達量，除常規N端融合表達蛋白外，我們還提供C端融合標簽，在確保純度的同時使其具有活性可能更高。 |
5-10工作日 | |
| PCR擴增產物酶切連接到pPic9k,pPic3.5k,pPiczαA等載體上 | |||||
| 轉化TOP10宿主 | |||||
| 獲得測序正確的重組質粒 | |||||
| 2 | 轉化及菌株鑒定
 |
重組質粒大量制備 | 高拷貝篩選 通過不同載體特有的篩選標記進行多輪篩選，逐步得到表達量最高的菌株。 |
銅離子脅迫專利 轉化后免篩選直接可獲得高表達量菌株，時間相比傳統篩選減少5-10工作日。 |
10-13工作日 |
| 線性化重組質粒 | |||||
| 電擊轉化至GS115、X33、KM71等宿主 | |||||
| PCR鑒定挑選陽性菌株 | |||||
| 用遺傳霉素G418、Zeocion等抗生素進行多拷貝子篩選，獲得高拷貝子 | |||||
| 3 | 小試及放大表達純化
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小試表達篩選（20-40株） | 7-12工作日/15-25工作日（特色純化） | ||
| 定株，優化表達條件 | |||||
| 放大培養 | |||||
| 通過親和、離子交換、疏水及分子篩等多種層析方法純化目的蛋白 | 多條件純化策略（可選） 完善的DOE方案，利用AKTA對離子交換、疏水等層析條件進行摸索，鎖定最適純化策略。 |
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| 4 | 其他（可選）
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通過酶切去除標簽或采用無標簽載體表達 | 靈活的附加服務（可選） 提供多種附加服務，客戶可根據實驗需求靈活選擇 |
3工作日 | |
| 提供無菌過濾及內毒素去除服務 | 2工作日 | ||||
| 5 | 質控
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蛋白濃度、純度等檢查，并提供QC報告 | 詳細的質控報告 為每個項目提供產品說明書及完善的質控報告 |
3-5工作日 | |
| 總時間 | 25-40工作日 | ||||
特色表達體系
● pPic9k-JT質粒+GS115菌株高效表達
載體特色
- 攜帶有AOX1強啟動子，含有alpha分泌因子可高效分泌表達；
- 無縫克隆連接不懼任何內切酶位點；
- 多個線性化位點：SalⅠ，SacⅠ，BglⅡ；
- 原核階段可進行Amp和Kan雙抗性篩選陽性菌株；
- 真核階段可進行His+和G418篩選高表達菌株；
- 改造過的多克隆位點，克隆不受目的基因中潛在的核酸內切酶位點限制；
- 載體自帶his 標簽，方便克隆與純化。
● pPic9k-SUMOSTAR質粒+GS115菌株高效表達
載體特色
- 攜帶有AOX1強啟動子，含有alpha分泌因子可高效分泌表達；
- 含有SUMOSTAR融合蛋白，具有很強促表達能力；
- 無縫克隆連接不懼任何內切酶位點；
- 含有EK酶切位點，酶切可得到無標簽蛋白；
- 多個線性化位點：SalⅠ，SacⅠ；
- 原核階段可進行Amp和Kan雙抗性篩選陽性菌株；
- 真核階段可進行His+和G418篩選高表達菌株；
- 改造過的多克隆位點，克隆不受目的基因中潛在的核酸內切酶位點限制；
- 載體自帶his 標簽，方便克隆與純化。
案例展示
案例1: 酵母表達系統表達高純度蛋白
難點：酵母胞內表達，破菌后純化，可以看出裂解液中雜蛋白非常多（泳道1），目的蛋白非常不明顯，經過酵母系統特有的層析系統一次純化，用SDS-PAGE檢測看不到雜帶，純度達到95%以上（泳道6-7）。
泳道1：裂解液
泳道2：上樣穿透液
泳道3：Marker
泳道4-7：不同梯度洗脫下來的目的蛋白
泳道1：裂解液
泳道2：上樣穿透液
泳道3：Marker
泳道4-7：不同梯度洗脫下來的目的蛋白
特點：酵母分泌表達，蛋白表達后直接分泌到培養基中，基本無雜蛋白，本身純度就高達90%以上，通過純化主要是去除色素及培養基中其他殘留物質，只留下在適宜緩沖中的目的蛋白。
泳道1：發酵液上清
泳道2：Marker
泳道3：上樣穿透液
泳道4：洗脫下來的目的蛋白
案例2: 酵母表達系統表達大分子量蛋白
難點：700氨基酸以上，81kDa，為了得到較高純度，選擇分泌載體進行表達，成功表達并分泌出來。
泳道1：發酵液上清
泳道2：上樣穿透液
泳道3：洗脫下來的目的蛋白
泳道4：Marker
案例3: 酵母表達系統表達小分子蛋白
難點：46氨基酸，7kDa，分子量非常小，相對來說不太容易檢測及濃縮，從SDS-PAGE檢測圖來看表達、純化、收集都非常成功。
泳道1：發酵液上清
泳道2：洗脫下來的目的蛋白
泳道3：Marker
難點：36氨基酸以上，4kDa，分子量非常小，而且這個客戶要求切除標簽，在分子量本身就很小的情況下切除標簽是非常有難度的，但我們經過一系列處理后成功將標簽切除，且WB用標簽抗體檢測目的蛋白中不含蛋白標簽，最終得到了高純度、小分子量的無標簽蛋白。
案例4：酵母表達系統表達N-型糖基化修飾蛋白
特點：接近天然蛋白的修飾，尤其是糖基化修飾在酵母表達系統特別明顯，用SDS-PAGE檢測呈彌散狀條帶且偏大，經過去N-型糖基化修飾的Endo H酶消化，帶型變實且大小與理論值吻合。
泳道1：純化后的目的蛋白（N-型糖基化修飾）
泳道2：經Endo H去糖基化修飾后的蛋白
泳道3：Marker
聯系信息
電話：027-87002556
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