ELISA試劑盒常見問題及預防措施
酶聯免疫吸附測定（ELISA）是指將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
但在實際操作及分析中，總會出現各種問題，本次就ELISA常見問題分析匯總，希望對科研菌的實驗有所幫助。
問題1：高背景/非特異性染色
| 結果描述 | 可能的原因 | 建議或預防措施 |
|---|---|---|
| 終止后，整板結果顯現均一的黃色或淡黃色；或標曲有線性但背景過高 | 整板發黃現象可能由于錯加其他試劑造成 | 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。 |
| 未充分清洗酶標板 | 確保清洗過程中每個微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后，將酶標板用力按壓在吸水紙上，以除去殘余的緩沖液。 | |
| 孵育時間過長 | 嚴格按照說明書操作。 | |
| 酶標記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器或陽性對照污染了微孔 | 吸取不同的試劑時應更換吸頭，配置不同的試劑組分時，應使用不同的儲液器皿。操作時請使用移液器。 | |
| 檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高 | 檢查濃度計算是否正確或進一步稀釋后再使用。 | |
| 底物在使用前曝光或污染 | 加入底物前，應始終避光保存。 | |
| 顯色時間過長 | 嚴格按照說明書顯色時間操作。 | |
| 讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 | TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長。 |
問題2：白板
| 結果描述 | 可能的原因 | 建議或預防措施 |
|---|---|---|
| 顯色步驟結束后，酶標板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色 | 組分試劑混淆使用 | 配制或使用時應看清楚標簽。 |
| 洗板及加樣過程中，酶標物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認配制洗液的容器已洗干凈。 | |
| 遺漏了某種試劑或某個步驟 | 詳細審閱說明書，并嚴格遵循操作步驟。 |
問題3：顯色淡
| 結果描述 | 可能的原因 | 建議或預防措施 |
|---|---|---|
| 包括標曲、樣本在內的所有板孔顏色均較淡。 | 試劑盒超過有效期或儲存不當 | 請在有效期內使用，并按照說明書推薦的保存條件保存，避免污染。 |
| 試劑、樣品用前未平衡 | 所有試劑、樣品應置室溫平衡 30min左右。 | |
| 移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸頭內壁掛液太多或內壁不清潔 | 校正移液器，吸頭要配套，每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快，排放應完全。吸頭內壁要清潔，最好一次性使用。 | |
| 孵育反應時間不足 | 定時器準確定時 | |
| 顯色反應時間不足 | 一般在15-30min，20min為佳，特殊除外。 | |
| 顯色劑加入順序顛倒（雙組分） | 請嚴格按說明書。 | |
| 洗滌次數增加，濃縮洗液稀釋倍數不符合要求 | 減少洗滌沖擊力，按說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時間，準確記錄洗滌次數及用量。 | |
| 蒸餾水水質有問題 | 配制好的洗液一定要檢測PH值是否呈中性。 | |
| 洗板及加樣過程中，酶標物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。 | |
| 標曲正常，樣本顯色較淡. | 樣本使用NaN3防腐，抑制了酶的反應 | 樣本不可使用NaN3。 |
| 待測標本中可能不含強陽性標本，故結果可能是正常的 | 如有懷疑，可復檢。 | |
| 目測結果正常，但酶標儀讀值偏低 | 讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 | TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長。 |
問題4：標準曲線不佳/重復性不好
| 結果描述 | 可能的原因 | 建議或預防措施 |
|---|---|---|
| 重復性差 | 標準品配制有誤 | 嚴格按照說明書標準品配制進行操作。僅使用推薦的稀釋液對標準品進行稀釋。 |
| 試劑盒儲存方法不當或儲存環境太差 | 請在說明書推薦的保存條件下保存，不要將重懸后的組分在室溫放置時間過長。 | |
| 過早稀釋各工作組分 | 各工作組分請在使用前10分鐘配制，并立即加入到微孔中。 | |
| 樣本加入后未混勻 | 針對同時加入多種試劑組分，加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩拿穩放，防止外濺。 | |
| 酶標儀測定重復性差 | 校準酶標儀。 | |
| 孵育時間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 | 重復測定標本，反應條件、人員等盡可能與上次保持一致。 | |
| 洗滌不正確 | 移液器準確加入200μl/孔洗滌液或注滿各孔，但不要溢出。洗板機洗板時不應有堵孔，洗滌應充分。 | |
| 孵育溫度恒溫效果不好 | 保證溫度恒定，避免局部溫度過高過低。 | |
| 加液時，過多殘留于孔壁上 | 加液時，吸頭在不碰到孔底的前提下盡量沿著孔壁下方加液。 | |
| 耗材重復使用 | 吸取不同的試劑時應更換吸頭，配置不同的試劑組分時，應使用不同的儲液器皿。 | |
| 微孔底部被劃傷或存在污垢 | 操作時細心，注意不要觸碰底部。擦拭酶標板底部，以去除污垢或指紋。 | |
| 閾值附近時陰時陽 | 同一樣品做3個復孔，以2個（含2個以上相同結果為準）。 | |
| 加樣時交叉污染 | 加標本時盡量避免交叉污染。 | |
| 出現隨機性的花板、跳孔現象 | 手工洗板造成的交叉污染 | 手工洗板時前 3次注洗液后應立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染。 |
| 拍板時交叉污染 | 拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同一位置拍，以免交叉污染。 | |
| 洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔 | 疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。 | |
| 樣本離心處理不全，致使反應孔內發生凝血現象或存在沉淀物或殘留細胞成分干擾 | 血清血漿應充分離心，3000rpm 6min以上。 | |
| 樣品放置時間過長，污染 | 樣品應保持新鮮，或低溫保存，防止污染。 | |
| 洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 | 按說明書配制。 |
